如何使用RT-PCR诊断COVID-19?

我们已经讨论过聚合酶链反应(PCR)测试之前。但“在野外”的诊断方法与实际情况略有不同用于实验室．

有多种方法可以可视化DNA。传统上，DNA作为PCR的模板，结果显示在凝胶电泳．

检测COVID-19的问题是，病毒没有DNA。RNA。这意味着这个过程需要额外的步骤。

在这种情况下，我们使用一种特殊的PCR称为逆转录酶PCR (RT-PCR)。

为什么COVID-19与DNA不同?

DNA是由一长串被称为核苷酸的遗传物质组成的双链。它是相对稳定的，使它理想地用于诊断测试。

另一方面，RNA只是一个单链核苷酸——但它很容易降解。在PCR测试中，一个叫做逆转录的过程将RNA转化为DNA。与任何其他类型的PCR一样，一种特殊的、独特的引物识别目标序列——在这种情况下是病毒RNA。在COVID-19诊断方面，可提供特殊套件是SARS-CoV-2特有的。

诊断的第二个问题是，PCR检测和凝胶电泳需要很长时间，甚至可能需要一整天。然而，实时RT-PCR机器几乎可以立即显示积累结果，整个过程可以在2-4小时内完成。

这个过程需要完成才能得到正确的诊断，但是随着时间的推移，看到结果变得越来越清晰，可以让运行测试的人检查这个过程是否工作。

RT-PCR是如何工作的?

在实时RT-PCR机器中，样品使用荧光灯进行测试，因为构建逆转录DNA的每个核苷酸都有荧光染料。

如果病毒存在于样本中，它就会发出荧光。DNA越多，发光的就越多。如果样品中没有病毒，它就不会发出荧光，因为没有建立荧光链。

随着时间的推移，DNA积累，机器测量每个样本中的荧光量，并将其显示在屏幕上。这些数据有助于计算阳性结果是强是弱。

这张图片显示了三个实时RT-PCR样本，比较了荧光水平与PCR循环数(AKA，在机器中的时间)。水平线表示精确测定独特荧光所需的荧光水平。

在本例中，三个样本在不同的时间达到该阈值水平。达到阈值所需的时间越长，开始使用的模板就越少。在这种情况下，我们可以认为样本三是弱阳性，因为一开始并没有太多病毒。

实时rt - pcr的整个过程是非常可靠的，但有时也会出现假阳性。实验室错误——不良样本、交叉污染、文书错误——是假阳性的主要原因。然而，有时特殊的引物扩增错误的DNA，但这是不常见的。

在后一种情况下，这种情况有时发生在人们曾经被感染但病情好转时。这是因为它们的系统中仍然有病毒RNA的痕迹。别担心，它们已经不会传染了!

有时，诊断使用一种特殊的探针来识别正确的DNA，而不是荧光，但它仍然是一种有用的检测形式。

假阳性的比率是多少?

总的来说，假阳性发生在0.8%-4%的样本中发生的2.3%．诊断茶会重新检测任何呈阳性的样本，尤其是那些看起来呈弱阳性的样本。这降低了实验室错误或污染导致阳性结果的机会。

高精度PCR检测和阳性检测的重采样相结合意味着实时RT-PCR结果非常可靠。

假阴性的可能性更高，因为任何导致PCR“失败”的东西看起来都是阴性的。据介绍，这种情况可能是由于样品质量差或实验室错误造成的，并且可能发生在高达10%的样品中回顾．

然而，每个PCR都有一个阴性对照——一个已知为阴性的样本。在这种情况下，结果不阈值，但可能看起来不同的控制。这意味着他们可以重新测试，看看是否是假阴性。